低温状态，细胞能否存储，保持活性，有一个避不开的话题：冰晶。我们技术团队很荣幸有机会聆听清华大学曹海山副教授的研究团队对于细胞低温保存玻璃化技术的讲座。
使用玻璃化技术的生物材料存活率会更高。在将生物材料冷却时，经常使用冷冻保护剂（CPA）。
为了更好地理解玻璃化和结晶过程，清华大学曹海山副教授的研究团队通过使用高速显微镜、相机和拉曼光谱仪，报告了用不同浓度的二甲基亚砜（DMSO）溶液冷冻保护的洋葱表皮细胞的结晶和玻璃化的动态过程。
在实验中使用的低温显微镜系统主要包括一个生物显微镜，配备了一个冷却台和一个高速相机。冷却台的温度由Linkam控制器调节，从-196℃到100℃，精确度为0.01℃。冷却或升温的速度可以在0.01℃/min到130℃/min的范围内控制。
研究者用低温显微镜观察到了冷却过程中细胞内和细胞外液的五种结晶和玻璃化现象。
在冷却速度为10℃/min至130℃/min的情况下，0-30%DMSO溶液中的细胞都会结晶。对于浸泡在0-20%DMSO溶液中的细胞，冰晶首先在观察区外的细胞外空间形成核。冰晶的生长和传播到观察区，直到该区结晶，对于浸泡在30%DMSO溶液中的细胞，细胞内冰晶的传播先于细胞外冰晶的传播（图1A-1B）。
图1A-1B
单个细胞中胞内冰晶的形成有三种模式（图1C），模式一，冰晶的生长从细胞一侧的成核点开始，然后向细胞内传播。模式II，冰晶的生长从细胞两边的两个成核点开始，然后传播到细胞的中心。模式III，冰晶的生长从细胞内的一个成核点开始，然后传播到细胞的边界。
图1C
细胞外结晶和细胞内玻璃化
以130℃/min的冷却速度，浸泡在40%DMSO溶液中的细胞冷却到-140℃，细胞内的液体被玻璃化。然而，非晶相不是纯粹的玻璃状固体，而是嵌入玻璃状基质的纳米/微晶域（图3）。
细胞外和细胞内的玻璃化作用
在冷却速度为1℃/min的冷却过程中，浸泡在50-70%DMSO溶液中的细胞的细胞内和细胞外液都转变为具有纳米/微晶域的玻璃基质（图4A）。随着温度从-50℃降到-140℃，浸泡在50%DMSO溶液中的细胞，纳米/微晶域的晶体面积分数从0%增加到6.6%（图4B）。当细胞从室温冷却到-140℃时，晶体面积分数从高到低依次是浸泡在50%、70%和60%DMSO溶液中的细胞。因此，并不是DMSO浓度越高，低温保存就越有效。
当细胞从室温冷却到-140℃时，随着冷却速率的增加，晶体面积分数下降（图4C）。
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